黑曲霉发酵豆粕的研究
添加时间：2015-8-18
豆粕是畜禽最重要的植物性蛋白源[1]。豆粕中粗蛋白含量最高可达43%~48%[2],并具有较平衡的氨基酸组成[3]，但是豆粕中存在一些抗营养因子（如胰蛋白酶抑制剂、脲酶、植酸、大豆凝血素等）[4]，它们对动物吸收利用有影响。如果直接将豆粕添加到仔猪饲料中会引起仔猪腹泻，导致消化吸收功能紊乱[5-6]，所以常用鱼粉作为饲料蛋白源。而鱼粉存在价格昂贵、资源有限、不耐储藏等问题[7]。因此,开发优质廉价的蛋白源对饲料工业有重要意义。
通过微生物发酵豆粕不仅能够提高豆粕中蛋白含量，还能够降解豆粕中存在的抗营养因子，使经过发酵后的豆粕更有利于动物的消化吸收[8]。发酵豆粕技术最早始于欧洲，2000年后在国内逐渐发展起来。一般发酵豆粕通常用芽孢杆菌，发酵后蛋白含量能达到50%左右，但很难进一步提高。与芽孢杆菌相比，黑曲霉具有产酶能力强、酶系丰富等特点。本实验尝试采用黑曲霉发酵豆粕，利用黑曲霉强大的产酶能力降解豆粕中的多糖和蛋白质,使其变成利于消化的低分子糖、小肽和氨基酸，并使得发酵豆粕蛋白含量得到很大提高。此外，黑曲霉发酵豆粕不产生真菌毒素，符合食品卫生要求，使豆粕营养品质大大改善，提高发酵豆粕在饲料工业中的利用率。
１ 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 微生物菌株
黑曲霉、毛霉、土曲霉、间型假丝酵母3号、热带假丝酵母621号（均为实验室保藏）。
1.1.2 实验原料
豆粕：东海粮油产品。
1.1.3 培养基
YPD培养基：1%酵母浸膏,2%蛋白胨,2%葡萄糖。
麸皮培养基：麸皮与水按1：1混合均匀。
黑曲霉种子培养基:麸皮10 g,料水比1：1,0.5%硫酸铵,0.5%磷酸二氢钾,装于250 ml三角瓶中,121 ℃灭菌30 min。
1.2 实验方法
1.2.1 菌种的培养及保藏
黑曲霉、毛霉和土曲霉用麸皮培养基在30 ℃培养3 d,然后取出置于50 ℃烘箱中烘干,粉碎作为接种备用。菌的保藏为主试管中用麸皮培养基培养后置于4 ℃冰箱保藏。
酵母的保藏用YPD培养基试管斜面保藏于4 ℃冰箱。发酵豆粕时先用YPD液体培养基(40 ml/250 ml三角瓶)培养24 h,然后接种豆粕中进行发酵。
1.2.2 发酵菌株的确定
分别用毛霉、黑曲霉、土曲霉、间型假丝酵母3号、热带假丝酵母621号菌株在罐头瓶（直径7 cm×高8 cm）中发酵豆粕。发酵量20 g，料水比1：1，发酵起始温度30 ℃，毛霉、黑曲霉、土曲霉的接种量均为1%，3号和621号酵母接种量为2 ml（在YPD中培养24 h），发酵时间均为3 d。测定发酵豆粕在绝干状态下蛋白含量。
1.2.3 豆粕发酵条件优化
研究不同的温度、料水比、接种量、发酵时间、发酵量5个因素对黑曲霉发酵豆粕的影响,设计5因素3水平的正交实验L18(3)5，正交表见表1。发酵后样品置于55 ℃烘干并粉碎,然后测定发酵后豆粕中的粗蛋白含量,最终得到最佳的发酵条件。
通过微生物发酵豆粕不仅能够提高豆粕中蛋白含量，还能够降解豆粕中存在的抗营养因子，使经过发酵后的豆粕更有利于动物的消化吸收[8]。发酵豆粕技术最早始于欧洲，2000年后在国内逐渐发展起来。一般发酵豆粕通常用芽孢杆菌，发酵后蛋白含量能达到50%左右，但很难进一步提高。与芽孢杆菌相比，黑曲霉具有产酶能力强、酶系丰富等特点。本实验尝试采用黑曲霉发酵豆粕，利用黑曲霉强大的产酶能力降解豆粕中的多糖和蛋白质,使其变成利于消化的低分子糖、小肽和氨基酸，并使得发酵豆粕蛋白含量得到很大提高。此外，黑曲霉发酵豆粕不产生真菌毒素，符合食品卫生要求，使豆粕营养品质大大改善，提高发酵豆粕在饲料工业中的利用率。
１ 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 微生物菌株
黑曲霉、毛霉、土曲霉、间型假丝酵母3号、热带假丝酵母621号（均为实验室保藏）。
1.1.2 实验原料
豆粕：东海粮油产品。
1.1.3 培养基
YPD培养基：1%酵母浸膏,2%蛋白胨,2%葡萄糖。
麸皮培养基：麸皮与水按1：1混合均匀。
黑曲霉种子培养基:麸皮10 g,料水比1：1,0.5%硫酸铵,0.5%磷酸二氢钾,装于250 ml三角瓶中,121 ℃灭菌30 min。
1.2 实验方法
1.2.1 菌种的培养及保藏
黑曲霉、毛霉和土曲霉用麸皮培养基在30 ℃培养3 d,然后取出置于50 ℃烘箱中烘干,粉碎作为接种备用。菌的保藏为主试管中用麸皮培养基培养后置于4 ℃冰箱保藏。
酵母的保藏用YPD培养基试管斜面保藏于4 ℃冰箱。发酵豆粕时先用YPD液体培养基(40 ml/250 ml三角瓶)培养24 h,然后接种豆粕中进行发酵。
1.2.2 发酵菌株的确定
分别用毛霉、黑曲霉、土曲霉、间型假丝酵母3号、热带假丝酵母621号菌株在罐头瓶（直径7 cm×高8 cm）中发酵豆粕。发酵量20 g，料水比1：1，发酵起始温度30 ℃，毛霉、黑曲霉、土曲霉的接种量均为1%，3号和621号酵母接种量为2 ml（在YPD中培养24 h），发酵时间均为3 d。测定发酵豆粕在绝干状态下蛋白含量。
1.2.3 豆粕发酵条件优化
研究不同的温度、料水比、接种量、发酵时间、发酵量5个因素对黑曲霉发酵豆粕的影响,设计5因素3水平的正交实验L18(3)5，正交表见表1。发酵后样品置于55 ℃烘干并粉碎,然后测定发酵后豆粕中的粗蛋白含量,最终得到最佳的发酵条件。
1.2.4 常规营养成分测定
粗蛋白按GB/T 6432—1994凯氏定氮法进行测定;
粗灰分按国标GB/T 6438—2007测定；
氨基酸按国标GB/T 618246—2000测定；
钙含量按国标GB/T 6436—2002测定；
磷含量按国标GB/T 6437—2002测定；
水解度测定参照刘建峰的甲醛滴定法[9]。
1.2.5 SDS-PAGE分析豆粕蛋白质条带分布
称取过60目豆粕1 g，加入0.03 mol/l Tris-HCl(pH值8.8)溶液20 ml，在室温下置于摇床上150 r/min浸泡1.5 h,然后8 000 r/min离心5 min,取上清液。对提取蛋白进行SDS-PAGE电泳。电泳后凝胶用含0.5%考马斯亮蓝G-250的10%醋酸溶液进行染色30 min,最后用10%醋酸溶液脱色。
1.2.6 胰蛋白酶抑制剂活性测定（参照吴非和霍贵成改进的BAPA法[10]）
样品空白和试剂空白：分别将1.0 ml样品稀释液和1.0 ml蒸馏水加入10 ml试管中。在37 ℃下保温20 min,各加入2.5 ml BAPA溶液,混合后在37 ℃下保温10 min,分别加入0.5 ml 30％醋酸溶液中止反应,混合均匀后各加入1.0 ml用Tris buffer溶液稀释的猪胰蛋白酶溶液。
样品和标准：分别吸取1 ml Tris buffer溶液(做标准)和1 ml样品稀释液于10 ml试管中，各加入2.5 ml BAPA溶液后于37 ℃保温20 min,加入1 ml猪胰蛋白酶溶液,然后保温10 min,最后加入0.5 ml 30％醋酸溶液中止反应。最后测定在410 nm下的吸光值。
1.2.7 脲酶活性的测定
根据GB/T 8622—88测定。
1.2.8 植酸的测定
参照康立新分光光度法[11]。
标准曲线的绘制：分别取植酸标准液(300 μg/ml)0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 ml于25 ml玻璃离心管中,各加入3 ml铁标准液和2 ml 3.5 mol/l氯化钠溶液,均加水至15 ml,用玻璃棒搅匀，置60 ℃ 水浴中加热20 min，取出冷却，用滤纸过滤。取滤液1 ml于25 ml比色管中，加入50 g/l盐酸羟胺溶液2 ml，振荡混匀，再加入1 g/l 邻菲罗啉液2 ml，用水稀释至刻度，摇匀，放置30 min。以试剂空白调零，在波长510 nm处用1 cm比色池测定各管溶液的吸光值A，用植酸含量为0的0号管的A0值依次减去各管的A值得△A，以标准系列各溶液的△A 对相应的植酸浓度作标准曲线或回归方程。各管对应得植酸浓度为0.0、1.6、3.2、4.8、6.4、8.0 μg/ml。
样品处理与测定:称取5 g粉碎的样品(过60目筛)放于提取器中,加入5％三氯乙酸-10％硫酸钠定容到100 ml,室温下振荡30 min,以3 600 r/min离心15 min,取上清液过滤，加蒸馏水稀释至100 ml, 吸取上清液10 ml于25 ml玻璃离心管中，加入3 ml铁标准液，加入2 ml水，余下操作同标准曲线的绘制，从标准曲线上查出样品相应的植酸浓度C。
1.2.9 大豆凝血素测定
参照徐晓峰和朱才测定方法[12]。
1.3 数据处理
数据用SAS 8.0统计软件进行方差分析，用Excel进行差异t检验。结果以平均值±标准差（X±S）表示。
2 结果与分析
2.1 黑曲霉菌株的确定
5种真菌分别发酵豆粕后蛋白含量(绝干状态)见表2，以未发酵的原豆粕作为对照。
从表2的结果可以看出用黑曲霉发酵后豆粕中的蛋白质含量有显著提高，并且明显高于其它菌株发酵豆粕的效果。故选择黑曲霉作为发酵豆粕的菌株。
2.2 黑曲霉发酵豆粕正交实验
通过正交实验L18（3）5找到黑曲霉发酵豆粕最佳的发酵条件，以发酵豆粕中粗蛋白含量来衡量实验结果的好坏，正交实验结果见表3，对正交结果进行方差分析见表4。
由表3可以看出6号(A2B3C3D1E1)、8号(A3B2C3D2E1)实验组合的发酵豆粕粗蛋白含量均能够达到60%以上，从正交实验中可以得出理论上的最佳发酵条件是A3B3C1D2E1，即温度35 ℃；发酵时间4 d；接种量0.5%；料水比1：1；发酵量20 g,又由表4可以看出在α=0.1水平上发酵时间对发酵后豆粕粗蛋白含量具有显著性影响，上面5个因素对发酵豆粕蛋白含量影响大小为:发酵时间>发酵量>起始温度>料水比>接种量,并且可以看出温度、接种量、料水比三因素对最后结果影响不大。取实验组A3B3C1D2E1和A3B2C1D2E1做验证实验,测定发酵后粗蛋白含量分别为61.25%和60.13%。综合上面分析,并且从实际工业生产需要来考虑，由于发酵3 d和4 d均能达到60%以上,并且差距不大,而发酵3 d能减少发酵时间周期,利于实际生产应用，所以取A3B2C1D2E1实验组，即黑曲霉在罐头瓶中发酵豆粕最佳条件为：起始温度35 ℃、发酵时间3 d、料水比1：1、接种量0.5%、发酵量20 g。未发酵豆粕蛋白含量43.5%，发酵后比原料中蛋白含量增加了38.23% (P<0.01)。
2.3 常规营养成分测定
豆粕经过黑曲霉发酵后与发酵前豆粕中的营养成分变化见表5。
由表5可以看出,发酵前后豆粕粗灰分含量稍有降低。粗蛋白含量显著提高，比发酵前提高了38.23%(P<0.01)。钙和磷含量也分别比发酵前提高了34.62%(P<0.01)和35.59%(P<0.01)，发酵后水解度达31.75%。
2.4 发酵前后氨基酸含量的变化（见表6）
由表6可知,氨基酸总含量由发酵前的39.68%提高到发酵后的53.87%，发酵后比发酵前氨基酸总含量提高了35.76%,各种氨基酸含量都有不同程度的提高。发酵前后蛋白含量的提高与氨基酸含量的提高基本符合，可认为发酵后豆粕中氮含量基本没有损失。
2.5 蛋白质电泳图分析
黑曲霉发酵对豆粕中蛋白质的影响如图1所示。
从图1中可看出,未发酵豆粕中大分子蛋白质占了很大比例,经过黑曲霉发酵后31 kD以上的大分子蛋白质条带已经很浅,表明大分子蛋白已被较好的降解,发酵后蛋白质多集中在25 kD以下,占有很大比例。
2.6 发酵对抗营养因子的去除效果
黑曲霉发酵前后豆粕中抗营养因子含量变化如表7所示。
由表7可看出，黑曲霉在最适发酵条件下发酵豆粕时，对豆粕中的主要抗营养因子能够进行比较好的降解，除了对胰蛋白酶抑制因子降解作用稍差外对植酸，脲酶和大豆凝血素都有很好的降解作用。
3 讨论
利用微生物发酵法处理豆粕由于其成本低，对饲料的营养成分破坏较小，可以提高蛋白质含量，同时还能够降解豆粕中存在的一些抗营养因子，提高豆粕的营养价值，是豆粕开发生产的热点。目前，国内外已有很多关于发酵豆粕的报道,在我国最早是康立新等用芽孢杆菌、酵母和乳酸菌混合发酵豆粕消除豆粕中的抗营养因子[13],去除效果显著,且工艺稳定,已经进行大规模工业化生产。国内其它有关豆粕发酵工艺研究都与之类似。在国外Hong等研究发现用米曲霉发酵豆粕能将大分子蛋白降解成小分子肽[14]。
本实验通过对几种微生物菌株的挑选，最终选择利用黑曲霉发酵豆粕提高豆粕蛋白含量，利用SAS 8.0软件设计正交实验优化黑曲霉发酵豆粕的条件，使得发酵后蛋白含量达到60%以上，各种氨基酸含量都得到相应提高。与其它菌株相比，用黑曲霉发酵豆粕对蛋白含量的提高有明显的优势，提高效果显著。而且发酵后豆粕中的几种主要抗营养因子得到了降解。大部分大分子蛋白都被降解成小分子肽，提高了豆粕的营养价值。此外，黑曲霉发酵豆粕具有不产生真菌毒素，菌丝体易形成，有丰富的酶系，便于工业生产，为发酵豆粕更好的代替鱼粉成为动物饲料蛋白源提供了可能，但大规模的进行工业化生产还有待进一步研究。
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